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乳糖酶是一种生物酶制剂,主要用来治疗乳糖不耐受症。研究人员利用基因工程技术,将人工优化的米曲霉乳糖酶基因(lacA)导入乳*克鲁维酵母细胞,获得了高效表达乳糖酶的重组菌株。下图1为载体PKLACl的限制酶切图谱(总长度为9091bp,bp表示碱基对;XhoⅠ、BglⅡ、SacⅡ表示限制酶,数字代表碱基的编号),amdS基因编码的乙酰*酶能够将乙酰*降解成氨,只有转化成功的乳*克鲁维酵母才能在乙酰*作为唯一氮源的培养基中生长。图2为含有lacA的DNA片段。
请回答下列问题:
(1)米曲霉合成并分泌至胞外的乳糖酶能将乳糖分解为________。
(2)优化后的米曲霉乳糖酶基因片段lacA中G-C碱基含量由原来的51.4%降低到39.2%,使乳*克鲁维酵母偏爱的密码子出现的频率大幅度增加,从而在不改变乳糖酶________序列的前提下,提高了重组菌株该基因表达中________(填具体步骤)的效率。
(3)将优化的米曲霉乳糖酶基因片段lacA与pKLACl分别使用用XhoⅠ、BelⅡ双酶切,然后用________连接,得到含目的基因的重组质粒(pKLAC1—lacA,长度为12040bp)。若目的基因置换了pKLACl中一段长33bp的片段,则目的基因的长度为________bp.
(4)用小剂量质粒提取试剂盒提取重组质粒,对所提取的重组质粒用SacⅡ单酶切后纯化,纯化产物用1%琼脂凝胶进行电泳检测。若结果如图3中的第________(填序号)泳道所示,则说明优化后的目的基因片段lacA成功构建在质粒pKLACl中。
(5)将重组质粒pKLACl-lacA用SacⅡ单酶切使其线*化,纯化后与感受态乳*克鲁维酵母细胞混合、转化。用________适当稀释细胞液,均匀地涂布于________平板上进行培养,富集并筛选重组菌株。将筛选出的重组菌株进行发酵培养120h,检测________,最终获得高效表达乳糖酶的重组菌株。
【回答】
葡萄糖和半乳糖 氨基* 翻译 DNA连接酶 2982 1、3 无菌水 以乙酰*作为唯一氮源 乳糖酶活*/活力
【解析】
基因工程技术的基本步骤: (1)目的基因的获取:方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 (2)基因表达载体的构建:是基因工程的核心步骤,基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 (3)将目的基因导入受体细胞:根据受体细胞不同,导入的方法也不一样,将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因*法和花粉管通道法;将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注*法;将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 (4)目的基因的检测与鉴定:分子水平上的检测:①检测转基因生物染*体的DNA是否*入目的基因--DNA分子杂交技术;②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术;③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术,个体水平上的鉴定:抗虫鉴定、抗病鉴定、活*鉴定等。
【详解】
(1)乳糖由葡萄糖和半乳糖组成,故乳糖酶能将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖。
(2)乳糖酶的化学本质是蛋白质,优化后的米曲霉乳糖酶基因片段lacA中G-C碱基含量由原来的51.4%降低到39.2%,使乳*克鲁维酵母偏爱的密码子出现的频率大幅度增加,从而在不改变乳糖酶氨基*序列的前提下,提高了重组菌株该基因表达中翻译的效率。
(3)乳糖酶基因片段lacA与pKLACl分别使用XhoⅠ、BelⅡ限制*酶酶切,然后用DNA连接酶连接,得到含目的基因的重组质粒。题干信息可知,载体PKLACl的限制酶切图谱总长度为9091bp,含目的基因的重组质粒(pKLAC1—lacA,长度为12040bp)。若目的基因置换了pKLACl中一段长33bp的片段,则目的基因的长度为12040909133=2982bp。
(4)重组质粒,用SacⅡ单酶切后,形成两个大小不同的DNA片段,结合图3,M是marker组,1、2、3号是酶切组,对比分析结果第1、3泳道所示,说明优化后的目的基因片段lacA成功构建在质粒pKLACl中。
(5)防止污染用无菌水适当稀释细胞液,均匀地涂布于以乙酰*作为唯一氮源平板上进行培养,富集并筛选重组菌株。将筛选出的重组菌株进行发酵培养120h,检测乳糖酶活*/活力,最终获得高效表达乳糖酶的重组菌株。
【点睛】
本题考查基因工程的相关知识,要求考生识记基因工程的原理及*作步骤,掌握基因工程各*作步骤的相关细节,能结合所学的知识准确答题,属于考纲识记和理解层次的考查。
知识点:基因工程
题型:综合题
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