大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷*的定点诱变仅需进行2轮PCR反应即可获得,...
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大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷*的定点诱变仅需进行2轮PCR反应即可获得,第一轮加诱变引物和侧翼引物,第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物,过程如图所示。请分析回答下列问题:
(1) 引物结合到互补DNA链时的温度称退火温度,常规PCR设定的退火温度通常是____。为了使两轮PCR反应在同一支试管中进行,引物设计时应考虑不同的退火温度,第二轮PCR的退火温度应该比第一轮____,第二轮PCR仍需加入的引物是____。
(2) PCR扩增的定点诱变产物通常需要连接到载体分子上才能表达出相应的*状,该定点诱变产物需具备____等结构才能进行转录和翻译。新发现UGA(终止密码子)可以对应一种新的氨基*,下图是已转录出的mRNA部分碱基序列,预测虚线框后的第一个密码子最多有____种。
(3) 欲将某功能蛋白的第17位Cys(UGU)改造成Ser(UCU),应将诱变引物设计包含____序列,该过程属于____技术范畴。
【回答】
55-60℃ 高 (另一种)侧翼引物 启动子和终止子 14 –AGA-或-TCT- 蛋白质工程
【分析】
PCR技术:
概念:PCR全称为聚合酶链式反应,是一项在生物体外复制特定DNA的核*合成技术。
原理:DNA复制。
前提条件:要有一段已知目的基因的核苷*序以便合成一对引物。
条件:模板DNA、四种脱氧核苷*、一对引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)。
过程:①高温变*:DNA解旋过程;②低温复*:引物结合到互补链DNA上;③中温延伸:合成子链。
PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶,高温条件下*键可自动解开
【详解】
(1)PCR中退火的温度要求为55-60℃;第二轮PCR会在同一支试管里以第一轮的产物作为扩增引物,因此退火温度需要设置的更高,以防止第一轮的引物结合到DNA上;第二轮PCR仍然需要加入另一种侧翼引物,以便进行另一条链的延伸。
(2)若要使得目的基因可以表达出蛋白质,则需要在产物上具备启动子和终止子,诱导基因转录;每三个相邻的碱基决定一个氨基*,被称为一个密码子,AUG是起始密码子,因此图中虚线框后的字母U是一个密码子的第一个碱基,由题意可知该位置不能不对应氨基*,不对应氨基*的终止密码子本来有3种,现在UGA(终止密码子)可以对应一种新的氨基*,因此可能的密码子有4×4-3+1=14种。
(3)由于Ser的密码子为UCU,因此再设计PCR引物(本质为DNA)时,需要包含–AGA-(作为模板链)或-TCT-(作为非模板链),该项技术属于蛋白质工程。
【点睛】
本题的难点是结合PCR的原理和过程推断大引物PCR定点突变的大致原理和过程,易错点是对所给虚线框后碱基构成密码子种类的考察,识记密码子的种类和终止密码子的数目,及对该题中编码氨基*的要求进行合适的分析是该易错点的解题方法。
知识点:DNA和蛋白质技术
题型:综合题
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