图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图,载体质粒P0具有四环素抗*基因(tetr)和氨苄青霉素抗*基因(a...
问题详情:
图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图,载体质粒P0具有四环素抗*基因(tetr)和氨苄青霉素抗*基因(ampr)。请回答下列问题:
(1)EcoRV酶切位点为,EcoR V酶切出来的线*载体P1为___________末端。
(2)用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段,其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷*。载体P1用酶处理,在两端各添加了一个碱基为___________的脱氧核苷*,形成P2;P2和目的基因片段在__________酶作用下,形成重组质粒P3。
(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落,采用含有不同抗生素的平板进行筛选,得到A、B、C三类菌落,其生长情况如下表(“+”代表生长,“﹣”代表不生长)。根据表中结果判断,应选择的菌落是__________(填表中字母)类,另外两类菌落质粒导入情况分别是_____、________________。
(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确*入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为*、乙、*3条引物在正确重组质粒中的相应位置,PCR鉴定时应选择的一对引物是__________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段,原因是_______________。
【回答】
平 胸腺嘧啶(T) DNA连接 B A类菌落含有P0 C类菌落未转入质粒 乙* 目的基因反向连接
【解析】
【分析】
基因表达载体的基本结构包括复制原点、目的基因、标记基因、启动子、终止子等。根据题干信息和图形分析,P0是载体质粒,其含有的氨苄青霉素抗*基因(ampr)和四环素抗*基因(tetr)都属于标记基因,可用于检测目的基因是否导入受体细胞;EcoRV酶为限制酶,其切割质粒后会破坏四环素抗*基因(tetr)。
【详解】
(1)根据题意分析,EcoRV酶识别的序列是-GATATC-,并且两条链都在中间的T与A之间进行切割,因此其切出来的线*载体P1为平末端。
(2)依题意并据图分析,目的基因两侧为黏*末端,且露出的碱基为A,则在载体P1的两端需要各加一个含有碱基T的脱氧核苷*,以便形成具有黏*末端的载体P2,再用DNA连接酶将P2与目的基因连接起来形成重组质粒P3。
(3)根据以上分析已知,限制酶(EcoRV酶)切割后破坏了四环素抗*基因,但是没有破坏氨苄青霉素抗*基因,因此含有重组质粒P3的菌落在含有四环素的培养基中应该不能生长,而在含有氨苄青霉素的培养基中能生长,结合表格分析可知,应该选择B类菌落。根据表格分析,A类菌落在氨苄青霉素和四环素的培养基中都能够生长,说明其导入的是P0;C类菌落在任何抗生素的培养基中都不能生长,说明其没有导入任何质粒。
(4)据图分析,根据目的基因*入的位置和PCR技术的原理分析,PCR鉴定时应该选择的一对引物是乙和*;根据题意和图形分析,某同学用图中的另外一对引物(*、乙)从某一菌落的质粒中扩增出了400bp的片段,说明其目的基因发生了反向连接。
【点睛】
解答本题的关键是识记并理解基因工程的四个基本步骤,尤其是对核心步骤——构建基因表达载体步骤的理解,明确基因表达载体的几个必须的成分及其作用,进而结合题干要求分析答题。
知识点:基因工程
题型:填空题
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